SEC-MALS确证新型冠状病毒表面S蛋白天然构象

与许多其他病毒一样,让新型冠状病毒入侵人体细胞的表面糖蛋白在形式上是三聚体。ACROBiosystems是一家以研发为目的,提供full-length新型冠状病毒spike蛋白的公司,该公司使用SEC-MALS以确保其提供的材料包含天然三聚体形式,以在开发抑制剂、诊断和疫苗方面得到最佳利用。我们拜访了ACROBiosystems首席执行官Mike Chen,他将为大家提供更多细节信息。

图1冷冻电镜分析获得的三聚体冠状病毒spike蛋白外区的正面和俯视图。三个S1原生质体(表面呈现)用红色、蓝色和绿色表示。S2 trimer采用浅橙色(RCSB PDB structure 6VYB)。


问:请描述贵公司提供的产品和服务?
答:ACROBiosystems侧重于制造重组蛋白和其他关键性试剂以支持靶向疗法的发展。公司采用结合实际应用的开发策略,特别注重产品设计、质量控制和帮助用户解决实际问题。我们的产品和服务使药物开发领域的任何人都能拥有更加直观和简化的流程。
ACROBiosystems的产品列表包括从人类到其他常见物种的疾病相关生物标记物和药物靶点。我们所有的产品都是以高质量和批次一致性生产的,以满足制药研发的严格标准。
ACROBiosystems通过提供额外的技术资源和定制服务、促进培训和沟通机会、在生物产业界发起合作以及在充满活力的全球和利基市场促进交易,继续增长和适应,为我们的客户带来更多价值。

问:最近你一直在提供2019年新型冠状病毒的full-length spike蛋白修剪器和抑制剂筛选试剂盒。请告诉我们,您如何预测客户的使用情况,以及他们的独特之处是什么?
答:在《Science》上发表的论文:Wrapp et al, Science, 2020 Mar 13;367(6483):1260-1263. http://doi.org/10.1126/science.abb2507,测定了新型冠状病毒表面三聚体在预融合构象中的3.5-angstrom-resolution冷冻电子显微镜结构。
为了促进医学对策的发展,我们开发了full-length S [spike - WTC] 蛋白质与修剪器结构。修剪后的蛋白更适合免疫和抗体筛查。

图2 新型冠状病毒抑制剂筛选试剂盒原理

修剪器的主要状态包含三个受体结合域 (RBD) 其中的一种,在受体可访问的构象中旋转。为了促进医学对策的发展,我们开发了full-length S [spike - WTC] 蛋白质与修剪器结构。修剪后的蛋白更适合免疫和抗体筛查。修剪器的主要状态包含三个受体结合域 (RBD) 其中的一种,在受体可访问的构象中旋转。作者还展示了生物物理和结构证据,证明了新型冠状病毒与SARS病毒相比具有更高的亲和力。
此外,市场上迄今尚未有有效治疗新型冠状病毒的药物,因此迫切需要开发新型冠状病毒抑制剂,例如治疗抗体和小分子化合物,以及针对新型冠状病毒的疫苗。这就是为什么ACROBiosystems开发了新型冠状病毒抑制剂筛选试剂盒。通过提供预标有生物结合的蛋白质,我们消除了耗时的标签过程,并大大简化了实验程序。此抑制剂筛选 ELISA 试剂盒旨在促进新型冠状病毒抑制剂的识别和表征。此外,我们还提供经MALS验证的S蛋白受体结合域(RBD)

问:您强调修剪器spike蛋白结构由 SEC-MALS 验证。您能告诉我们一些关于 SEC-MALS 的问题,以及为什么这对您的产品验证如此重要?

答:多角度光散射(MALS)是根据MW、浓度和散射光强度的关系确定蛋白质分子量的技术。此方法不依赖于洗脱量,也不要求标准蛋白质样品进行校准。
重组蛋白的正确折叠和组合对于免疫、抗体筛查和鉴定、抗体候选物功能验证、抗体药物质量控制和临床样本分析具有重要意义。溶液中蛋白质的寡聚状态将影响结构和暴露的活性位点。只有当蛋白质的第四元结构正确时,蛋白质才会有效地激活信号通路和生理功能。
然而,蛋白质的天然构象可能不符合球形蛋白质柱校准标准,特别是对于糖蛋白。试图根据列校准曲线确定此类蛋白质的分子量总是会产生不正确的结果。由于 MALS 不依赖保留时间来计算 MW,因此结果比传统的 HPLC-SEC 分析更准确、更可靠,后者根据洗脱时间计算 MW。

图3 a)光散射示意图;b1)散射光的强度与摩尔质量、浓度和折射率增量平方的乘积有关;b2)计算样品的MW。

我们使用 SEC-MALS 来确定三种商用抗体药物的 MW,包括 OKT3、Herceptin和Ipilimumab。如图3所示,这三种抗体的分子量实际上非常相似,但三种抗体的保留时间却大不相同。通过柱校准,OKT3抗体估计为212.5 kDa,而Ipilimumab仅为66.3 kDa,两者均与真正的分子量相差甚远。

柱校正计算分子量

图4三种不同抗体的分子量通过柱标分析SEC估计,与真实值相差很大。

另一方面,SEC-MALS确定的三种抗体的MW非常接近其理论(序列)MW,如图5所示。

SEC-MALS测定S蛋白的三聚状态

问:客户是否认识到了 SEC-MALS 在验证新型冠状病毒spike蛋白的寡聚状态的价值?

答:尽管 SEC-MALS 在确定溶液中蛋白质的寡聚状态具有固有价值,但我们认为大多数客户并不完全了解此方法的优点。我们打算与客户共享更多数据,以表明 SEC-MALS 准确测定 MW 对于生物聚合物分析非常重要。

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美国怀雅特技术公司,全球公认的光散射仪和分析软件制造商及行业领导者,公司产品主要用于表征溶液中大分子和纳米颗粒绝对分子量,尺寸,电荷以及相互作用。产品线涵盖多角度静态光散射仪,凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱光散射联用系统(GPC-MALS/SEC-MALS),场流/流场-光散射联用系统(FFF-MALS/AF5-MALS/HF5-MALS),以及梯度组分分析系统(生物大分子相互作用分析仪) (CG-MALS)。怀雅特不仅提供传统比色杯方式和在线测量的动态光散射仪,而且提供使用工业级多孔板直读高通量动态光散射仪。其它产品如高灵敏度电泳迁移率光散射仪(MP-PALS)/Zeta电位仪,示差折光检测器(dndc仪)以及粘度检测器。
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